流式細(xì)胞儀主要構(gòu)造和工作原理

一. 流式細(xì)胞術(shù)概述

     流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）是七十年代發(fā)展起來的高科學(xué)技術(shù),它集計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體, 同時(shí)具有分析和分選細(xì)胞功能。它不僅可測量細(xì)胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀,還可檢測細(xì)胞表面和細(xì)胞漿抗原、細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA含量等,可對(duì)群體細(xì)胞在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分析, 在短時(shí)間內(nèi)檢測分析大量細(xì)胞,并收集、儲(chǔ)存和處理數(shù)據(jù),進(jìn)行多參數(shù)定量分析; 能夠分類收集（分選）某一亞群細(xì)胞,分選純度＞95%。在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。
國內(nèi)使用的流式細(xì)胞儀主要由美國的兩個(gè)廠家生產(chǎn):BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司（簡稱B-D公司）。流式細(xì)胞儀主要有兩型:臨床型（又稱小型機(jī)、臺(tái)式機(jī)）和綜合型（又稱大型機(jī)、分析型）。BECKMAN-COULTER公司產(chǎn)品為EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D公司產(chǎn)品為FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是臨床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是綜合型，除具備檢測分析功能外,還具有細(xì)胞分選功能,多用于科學(xué)研究。

二.流式細(xì)胞儀主要技術(shù)指標(biāo)

1．流式細(xì)胞儀的分析速度：
一般流式細(xì)胞儀每秒檢測1000～ 5000個(gè)細(xì)胞,大型機(jī)可達(dá)每秒上萬個(gè)細(xì)胞。
2．流式細(xì)胞儀的熒光檢測靈敏度：一般能測出單個(gè)細(xì)胞上<600個(gè)熒光分子,兩個(gè)細(xì)胞間的熒光差＞5%即可區(qū)分。
3．前向角散射（FSC）光檢測靈敏度：前向角散射（FSC）反映被測細(xì)胞的大小,一般流式細(xì)胞儀能夠測量到0.2μm～０.5μm。
4．流式細(xì)胞儀的分辨率：通常用變異系數(shù)CV值來表示，,一般流式細(xì)胞儀能夠達(dá)到<2.0%,這也是測量標(biāo)本前用熒光微球調(diào)整儀器時(shí)要求必須達(dá)到的。
   5．流式細(xì)胞儀的分選速度：一般流式細(xì)胞儀分選速度＞1000個(gè)/秒，分選細(xì)胞純度可達(dá)99%以上。

三.流式細(xì)胞儀主要構(gòu)造和工作原理    流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)

流式細(xì)胞儀主要由以下五部分構(gòu)成:①流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)②激光光源及光束形成系統(tǒng)③光學(xué)系統(tǒng)④信號(hào)檢測與存儲(chǔ)、顯示、分析系統(tǒng)⑤細(xì)胞分選系統(tǒng)。
流動(dòng)室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式細(xì)胞儀的核心部件，流動(dòng)室由石英玻璃制成，單細(xì)胞懸液在細(xì)胞流動(dòng)室里被鞘流液包繞通過流動(dòng)室內(nèi)的一定孔徑的孔,檢測區(qū)在該孔的中心，細(xì)胞在此與激光垂直相交，在鞘流液約束下細(xì)胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū)。流動(dòng)室里的鞘液流是一種穩(wěn)定流動(dòng)，控制鞘液流的裝置是在流體力學(xué)理論的指導(dǎo)下由一系列壓力系統(tǒng)、壓力感受器組成，只要調(diào)整好鞘液壓力和標(biāo)本管壓力, 鞘液流包繞樣品流并使樣品流保持在液流的軸線方向，能夠保證每個(gè)細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時(shí)間相等，從而使激光激發(fā)的熒光信息準(zhǔn)確無誤。見圖12.1流動(dòng)室示意圖。流動(dòng)室孔徑有60μm、100μm、150μm 、250μm等多種，供研究者選擇。小型儀器一般固定裝置了一定孔徑的流動(dòng)室。
圖12.1流動(dòng)室示意圖（采自Coulter Training Guide）

 激光光源及光束形成系統(tǒng)

    流式細(xì)胞儀可配備一根或多根激光管，常用的激光管是氬離子氣體激光管，它的發(fā)射光波長488ηm,此外可配備氦氖離子氣體激光管（波長633ηm）和/或紫外激光管。

流式細(xì)胞儀的主要測定信號(hào)熒光是由激發(fā)光激發(fā)的，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與激發(fā)光的強(qiáng)度和照射時(shí)間相關(guān)，激光是一種相干光源,它能提供單波長、高強(qiáng)度、高穩(wěn)定性的光照，正是能達(dá)到這一要求的理想的激發(fā)光光源。
    在激光光源和流動(dòng)室之間有兩個(gè)圓柱形透鏡，將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束（22μm×66μm），在這種橢圓形激光光斑內(nèi)激光能量成正態(tài)分布，使通過激光檢測區(qū)的細(xì)胞受照強(qiáng)度一致。

光學(xué)系統(tǒng)

流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)由若干組透鏡、小孔、濾光片組成，大致可分為流動(dòng)室前和流動(dòng)室后兩組。流動(dòng)室前的光學(xué)系統(tǒng)由透鏡和小孔組成，透鏡和小孔（一般為2片透鏡、1個(gè)小孔）的主要作用是將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束，使激光能量成正態(tài)分布，使通過激光檢測區(qū)的細(xì)胞受照強(qiáng)度一致，zui大限度的減少雜散光的干擾；流動(dòng)室后的光學(xué)系統(tǒng)主要由多組濾光片組成，濾光片的主要作用是將不同波長的熒光信號(hào)送到不同的光電倍增管。濾光片主要有三類：長通濾片（LP）--只允許特定波長以上的光線通過，短通濾片（SP）-- 只允許特定波長以下的光線通過，帶通濾片（BP）-- 只允許特定波長的光線通過，不同組合的濾片可以將不同波長的熒光信號(hào)送到不同的光電倍增管（PMT）,如接收綠色熒光（FITC）的PMT前面配置的濾光片是LP550和BP525, 接收色橙紅色熒光（PE）的PMT前面配置的濾光片是LP600和BP575, 接收紅色熒光（CY5）的PMT前面配置的濾光片是LP650和BP675。見圖12.2光學(xué)系統(tǒng)和信號(hào)檢測系統(tǒng)示意圖。

信號(hào)檢測系統(tǒng)

    當(dāng)測定標(biāo)本在鞘流液約束下細(xì)胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū)時(shí)產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào),散射光分為前向角散射（Forward Scatter, FS）和側(cè)向角散射或900散射（Side Scatter, SS）,散射光是細(xì)胞的物理參數(shù)與細(xì)胞樣本的制備（如染色）無關(guān);熒光信號(hào)也有兩種,一種是細(xì)胞自發(fā)熒光它一般很微弱,一種是細(xì)胞樣本經(jīng)標(biāo)有特異熒光素的單克隆抗體染色后經(jīng)激光激發(fā)發(fā)出的熒光，它是我們要測定的熒光,熒光信號(hào)較強(qiáng),這兩種熒光信號(hào)的同時(shí)存在是我們測定時(shí)需要設(shè)定陰性對(duì)照的理由,以便從測出的熒光信號(hào)中減去細(xì)胞自發(fā)熒光和抗體非特異結(jié)合產(chǎn)生的熒光。

前向角散射（FS）反映被測細(xì)胞的大小,它由正對(duì)著流動(dòng)室的光電二極管裝置接收并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)；側(cè)向角散射或900散射（SS）反映被測細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核膜的折射率和細(xì)胞內(nèi)顆粒的性狀, 它由一個(gè)光電倍增管（PMT） 接收并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào),這些電信號(hào)存儲(chǔ)在流式細(xì)胞儀的計(jì)算機(jī)硬盤或軟盤內(nèi)。

流式細(xì)胞儀測定常用的熒光染料有多種,他們分子結(jié)構(gòu)不同,激發(fā)光譜和發(fā)射光譜也各異,選擇熒光染料時(shí)必須依據(jù)流式細(xì)胞儀所配備的激光光源的發(fā)射光波長（如氬離子氣體激光管,它的發(fā)射光波488ηm,氦氖離子氣體激光管發(fā)射光波長633ηm）。488ηm激光光源常用的熒光染料有FITC（異硫氰酸熒光素）、PE（藻紅蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP（葉綠素蛋白）、ECD（藻紅蛋白-得克薩斯紅）等。他們的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別是：
             激發(fā)光波長（ηm）       發(fā)射光峰值（ηm）
FITC            488                      525（綠）
PE              488                      575（橙紅）  
PI              488                      630（橙紅）
ECD             488                      610（紅）
CY5             488                      675（深紅）
PreCP           488                      675（深紅）
    各種熒光信號(hào)由各自的光電倍增管（PMT） 接收并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)后存儲(chǔ)在流式細(xì)胞儀的計(jì)算機(jī)硬盤或軟盤內(nèi).見圖12.2光學(xué)系統(tǒng)和信號(hào)檢測系統(tǒng)示意圖。

信號(hào)存儲(chǔ)、顯示、分析系統(tǒng)

（一） 信號(hào)存儲(chǔ)
存儲(chǔ)在流式細(xì)胞儀的計(jì)算機(jī)硬盤或軟盤內(nèi)的數(shù)據(jù)一般是以List mode（列表排隊(duì)）方式存入的,采用List mode方式有兩大優(yōu)點(diǎn):①節(jié)約內(nèi)存和磁盤空間②易于加工處理分析。
（二）信號(hào)顯示和分析
由于List mode方式數(shù)據(jù)缺乏直觀性，數(shù)據(jù)的顯示和分析一般采用一維直
方圖（圖12.3）、二維點(diǎn)陣圖（圖12.4,12.5）、等高線圖（圖12.8）和密度圖（圖12.7）。
     1．單參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析  細(xì)胞的每一個(gè)單參數(shù)測量數(shù)據(jù)用直方圖來顯 示，圖中橫坐標(biāo)表示散射光或熒光信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度值，其單位是道數(shù)，可以是線性的，也可以是對(duì)數(shù)的；縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)。見圖12.3一維直方圖，圖中橫坐標(biāo)是FITC熒光信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度值（對(duì)數(shù)），縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù);圖中已根據(jù)陰性對(duì)照設(shè)定適當(dāng)?shù)?ldquo;門”（直線門），儀器的計(jì)算機(jī)就會(huì)給出測定值（包括陽性細(xì)胞%和平均熒光強(qiáng)度）。

2.雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析  細(xì)胞的雙參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系用一維直方圖、二維點(diǎn)陣圖、等高線圖和密度圖顯示和分析。如圖12.4二維點(diǎn)陣圖，是正常人外周血白細(xì)胞的前向散射光（FS）和側(cè)向散射光（SS）組成的點(diǎn)陣圖，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)均是線性的，圖中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞很明顯地分為3群，可以很容易地圈“門”（ Bitmap，無定型門），分析各亞群細(xì)胞的數(shù)據(jù);圖12.6假三維地形圖（X軸: SSC ,Y軸:FSC Z軸:細(xì)胞數(shù)）更清楚地表明這一點(diǎn)。圖12.5二維點(diǎn)陣圖是細(xì)胞的兩種熒光（FITC和RD1）雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)均是對(duì)數(shù)的，橫坐標(biāo)代表FITC，縱坐標(biāo)代表PE，圖中已設(shè)定適當(dāng)?shù)?ldquo;門”（十字門），十字門的D1、D2、D3、D4門分別代表PE單陽性細(xì)胞、PE和FITC雙陽性細(xì)胞 、陰性細(xì)胞、FITC單陽性細(xì)胞。儀器的計(jì)算機(jī)就會(huì)給出兩種熒光測定值（包括陰性細(xì)胞%、兩種熒光各自的陽性細(xì)胞%、兩種熒光的雙陽性細(xì)胞%、各群細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度）。 圖12.7和圖12.8分別是測定細(xì)胞的兩種熒光雙參數(shù)數(shù)據(jù)的密度圖和等高線圖，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)分別代表一種熒光參數(shù)，同理只要設(shè)定十字門就可得到兩種熒光的各種測定值，密度圖和等高線圖較點(diǎn)陣圖更直觀。
   3．三參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析  細(xì)胞的三參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系每兩個(gè)數(shù)據(jù)組成一對(duì)（三參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細(xì)胞數(shù)量每兩個(gè)數(shù)據(jù)可組成6對(duì)數(shù)據(jù)）用一維直方圖、二維點(diǎn)陣圖、等高線圖和密度圖顯示和分析。三個(gè)熒光數(shù)據(jù)關(guān)系用分光圖（prism）表示，分光圖可直接給出8個(gè)數(shù)據(jù)（如用ABC代表3種熒光，可有A+B+C+、A+B+C- 、A+B-C-、 A-B+C+、 A-B+C-、 A-B-C+、 A+B-C+ 、A-B-C-）。見圖12.9 prism，圖12.9為人外周血淋巴細(xì)胞亞群測定結(jié)果的分光圖，圖中給出CD3、CD4、CD8組合的各種結(jié)果，如T輔助細(xì)胞（CD3+CD4+CD8-）為42.0%,如T抑制細(xì)胞（CD3+CD4+CD8-）為17.4%。

圖12.5兩種熒光的二維點(diǎn)陣圖（采自Coulter Operaters Guide） 
   圖12.7. 雙參數(shù)數(shù)據(jù)的密度圖（采自Coulter Operaters Guide）      
   圖12.6假三維地形圖和二維點(diǎn)陣圖（采自Coulter Operaters Guide）
   圖12.8雙參數(shù)數(shù)據(jù)的等高線圖（采自Coulter Operaters Guide）
   圖12.9 分光圖（prism）

細(xì)胞分選系統(tǒng)

 如在細(xì)胞流動(dòng)室上裝有超聲壓電晶體,通電后超聲壓電晶體發(fā)生高頻震動(dòng)，可帶動(dòng)細(xì)胞流動(dòng)室高頻震動(dòng),使細(xì)胞流動(dòng)室噴咀流出的液流束斷成一連串均勻的液滴, 每秒鐘形成液滴上萬個(gè)。每個(gè)液滴中包含著一個(gè)樣品細(xì)胞,液滴中的細(xì)胞在形成液滴前已被測量,如符合預(yù)定要求則可被充電,在通過偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場時(shí)向左或向右偏轉(zhuǎn)被收集在容器中,不含細(xì)胞液滴或細(xì)胞不符合預(yù)定要求液滴不被充電亦不發(fā)生偏轉(zhuǎn)進(jìn)入中間廢液收集器中,從而實(shí)現(xiàn)了分選。分選的詳細(xì)原理和操作請(qǐng)有興趣者參考有關(guān)文獻(xiàn)。