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凱氏定氮法測定人血白蛋白中蛋白質(zhì)含量的不確定度評價

更新時間:2011-01-20      點(diǎn)擊次數(shù):4298
蛋白質(zhì)含量是人血白蛋白質(zhì)量評價的重要指標(biāo)。不確定度是與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù),表征合理地賦予被測量值的分散性。本文對凱氏定氮法測定人血白蛋白中蛋白質(zhì)含量的不確定度來源和大小進(jìn)行分析和評價,并初步探討在運(yùn)用該方法的過程中應(yīng)注意的問題,旨在為人血白蛋白以及食品(尤其是乳制品)中的蛋白質(zhì)含量測定提供一定參考。推薦使用儀器:KDN-08A,蛋白質(zhì)測定儀http://www.dsddy.cn/)。
 實(shí)驗(yàn)材料及條件
1.1 儀器及試藥
儀器:自動定氮儀( Gerhardt Vapodest 30 DigestSystem) ;玻璃儀器( 1、2、10 mL 移液管; 20、100 mL容量瓶; 25 mL酸式滴定管) , 20 ℃下校準(zhǔn)。試藥:人血白蛋白(貴陽黔峰生物制品有限公司生產(chǎn), 批號為20070830, 規(guī)格為20% , 10 g) ;01005 mol·L - 1硫酸滴定液(本所化學(xué)室標(biāo)定) ;10%鎢酸鈉溶液; 0133 mol·L - 1硫酸溶液; 2%硼酸溶液; 40%氫氧化鈉溶液;甲基紅-溴甲酚綠混合指示液; 98%硫酸;無水硫酸鈉;硫酸銅。
1.2 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境
溫度變化范圍: (20 ±4) ℃。
 方法
2.1 試驗(yàn)過程
按照中國藥典2005年版三部的規(guī)定,測定人血白蛋白中的蛋白質(zhì)含量,過程見圖1。
2.2 建立數(shù)學(xué)模型
人血白蛋白中蛋白質(zhì)含量W 的計(jì)算公式為:
rep為總重復(fù)性因子。
以y表示W(wǎng) , xi表示第i個影響參數(shù),得y的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
其中ci為靈敏系數(shù),記為偏導(dǎo)5y /5x; u ( y, xi )為由xi不確定度引起的y的不確定度。
 不確定度的來源及分析
3.1 不確定度的來源
從人血白蛋白中蛋白質(zhì)含量測定流程圖來看,凱氏定氮法測定蛋白含量的不確定度主要來源于9個方面: 1)試驗(yàn)重復(fù)性; 2)標(biāo)定硫酸滴定液濃度; 3)稀釋硫酸滴定液; 4)測定總氮稀釋樣品; 5)滴定總氮吸取樣品; 6)滴定總氮實(shí)際消耗硫酸滴定液的體積; 7)測定非蛋白氮稀釋樣品; 8)滴定非蛋白氮吸取樣品; 9)滴定非蛋白氮實(shí)際消耗硫酸滴定液的體積。
3.2 不確定度u ( xi )的量化分析
3.2.1 由試驗(yàn)重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u ( rep)按藥典標(biāo)準(zhǔn)對人血白蛋白樣品平行測定6次,結(jié)果見表1。
 測量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度: u ( rep) = s /6015 = 01002 4
3.2.2 標(biāo)定硫酸滴定液濃度引入的不確定度u (CD )由標(biāo)定01005 mol·L - 1硫酸滴定液所引入的不確定度u (CD ) = 111 ×10- 4 mol·L - 1。
3.2.3 稀釋硫酸滴定液引入的不確定度u (VD1 / VD2 )
試驗(yàn)中需將01052 32 mol·L - 1硫酸滴定液定量稀釋成01005 232 mol·L - 1 ,根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》查得,*1010 mL移液管和*100 mL容量瓶的允許偏差分別為±0102和±0110 mL ,近似于三角形分布,換算成校準(zhǔn)不確定度分別為: 0102 /6015 = 01008 2 mL, 0110 /6015 = 01041 mL。該容量瓶和移液管均在20 ℃校準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)室溫度變化范圍為(20 ±4) ℃,近似于矩形分布。水的膨脹系數(shù)為211 ×10- 4。換算成溫度不確定度分別為:
3.2.4 測定總氮稀釋樣品(VT1 / VT2 )引入的不確定度u (VT1 / VT2 )
由《常用玻璃量器檢定規(guī)程》可知,*110 mL移液管和A 級20 mL 容量瓶的允許偏差分別為±0.007和±0.02 mL,近似于三角形分布,換算成校準(zhǔn)不確定度分別為:
3.2.5 滴定總氮吸取樣品(VT3 )引入的不確定度u (VT3 )與“31214”項(xiàng)相同,*110 mL移液管的的校準(zhǔn)不確定度為01002 9 mL,溫度不確定度為01000 48 mL。
由上述不確定度分量合成得:
u (VT3 ) = (01002 92 + 01000 482 ) 015 = 01002 9 mL
3.2.6  滴定總氮實(shí)際消耗硫酸滴定液的體積(VT4 - V0 )引入的不確定度u (VT4 - V0 )1)肉眼判斷終點(diǎn)所引入的不確定度已包含在測量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u ( rep )中,此處不再考慮; 2)滴定管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:由《常用玻璃量器檢定規(guī)程》可知, 2510 mL的*滴定管其zui大容量的允許偏差為±0104 mL ,近似于三角形分布,換算成校準(zhǔn)不確度為:
3.2.7 測定非蛋白氮稀釋樣品(VN1 / VN2 )引入的不確定度u (VN1 / VN2 )由《常用玻璃量器檢定規(guī)程》可知,*210 mL移液管和A 級20 mL 容量瓶的允許偏差分別為±01010和±0102 mL.,近似于三角形分布.,換算成校準(zhǔn)不確定度分別為:
3.2.8 滴定非蛋白氮吸取樣品(VN3 )引入的不確定度u (VN3 )
u (VN3 )即由510 mL 移液管引入的不確定度。由《常用玻璃量器檢定規(guī)程》可知, *510 mL 移液管的允許偏差為±01015 mL. ,近似于三角形分布.,換算成校準(zhǔn)不確定度為:
01015 /6015 = 01006 2 mL
溫度不確定度為:
510 ×211 ×10 - 4 ×4 /3015 = 01002 4 mL
由上述不確定度分量合成得:
u (VN3 ) = (01006 22 + 01002 42 ) 015 = 01006 6 mL
3.2.9 滴定非蛋白氮實(shí)際消耗硫酸滴定液的體積(VN4 - V0 )引入的不確定度u (VN4 - V0 )
1)肉眼判斷終點(diǎn)所引入的不確定度已被包含在測量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u ( rep )中,在此處不再考慮。2)滴定管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:查標(biāo)準(zhǔn)得2510 mL的*滴定管其zui大容量的允許偏差為±0104 mL ,近似于三角形分布,換算成校準(zhǔn)不確度為:
3.3 不確定分量及各分量分析
在不確定度表達(dá)式中,假如y ( x1 , x2 , ?, xi )對xi是線性或與xi相比其u ( xi )較小,偏導(dǎo)( 5y /5x)可近似為:5y /5x≈ { y [ xi + u ( xi ) ] - y ( xi ) } /u ( xi )將u ( xi )計(jì)入,獲得因xi不確定度引起的y的不確定度u ( y, xi ) ,即:
u ( y, xi )≈ y{ x1 , x2 ?[ xi + u (xi ) ]?xn } - y (x1 , x2 , ?, xi , ?, xn )
根據(jù)上式,由各不確定分量u (xi )進(jìn)行計(jì)算可得到對應(yīng)的u (y, xi ) ,結(jié)果見表2。
314 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度的計(jì)算根據(jù)表2結(jié)果,可得合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度( uc )為:
擴(kuò)展不確定度(U)的計(jì)算公式為: U = k·uc置信因子( k)取2,即置信概率為95% ,可得:
U = 0.62% ×2 = 1.2%故人血白蛋白中蛋白質(zhì)含量W (% )可表示為(104.7 ±1.2) %。
 討論
根據(jù)小分量不確定度不足zui大分量不確定度的1 /3時,小分量不確定度可以忽略不計(jì)的原則,由以上的評定結(jié)果可看出,本方法測定結(jié)果的不確度主要來源于6個分量:測定總氮稀釋樣品的不確定度u (VT1 / VT2 ) 、滴定總氮吸取樣品的不確定度u (VT3 ) 、測量重復(fù)性u ( rep ) 、標(biāo)定硫酸滴定液濃度的不確定度u (CD ) 、滴定總氮實(shí)際消耗硫酸滴定液的不確定度u (VT4 - V0 ) 、稀釋硫酸滴定液的不確定度u (VD1 / VD2 ) 。
在試驗(yàn)中使用的玻璃儀器均為*,因此不能通過提高儀器的精密度改善結(jié)果,但可采取下述2個措施降低本方法的不確定度。1)使用較大規(guī)格的移液管。u (VT1 / VT2 ) 與u (VT3 ) 較大的原因是110 mL移液管引入的不確定度明顯大于較大規(guī)格的移液管。故在使用本方法測定樣品時,在樣品量允許的前提下,通過重新設(shè)計(jì)試驗(yàn)步驟,在吸取樣品時選用較大規(guī)格的移液管,將能顯著降低u (VT1 / VT2 )與u (VT3 ) 。2)使用合適的自動化儀器進(jìn)行樣品消化及滴定,同時規(guī)范試驗(yàn)操作,嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件,將能有效控制試驗(yàn)過程中產(chǎn)生的隨機(jī)誤差,從而降低u ( rep)。

 

本文來自:http://www.dsddy.cn/

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