食品中蛋白質(zhì)含量測定方法集錦
2008年毒奶粉事件再次敲響了食品安全的警鐘,不法分子為了提高摻水牛奶中蛋白質(zhì)的含量,添加工業(yè)原料三聚氰胺,由于我國現(xiàn)行標準GB/T5009.5-2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的2種方法“凱氏定氮法”和杜馬斯(Dumas)燃燒法只能測出含氮量,然后根據(jù)氮元素與蛋白質(zhì)換算系數(shù)計算蛋白質(zhì)的含量,但并不能區(qū)分牛奶硝化后氮的來源,如果添加違規(guī)化學物質(zhì),就可以測出較高的“蛋白質(zhì)含量”。三聚氰胺并非惟一的替代添加物,只要含氮量大于牛奶中蛋白質(zhì)的化學物質(zhì),且性狀和價格具備條件,在理論上都存在被不法分子利用的可能性。“定氮”方法的先天不足要求采用其它的檢測方法來應對,下面介紹幾種直接測定蛋白質(zhì)的方法。
考馬斯亮蘭法:1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法,是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結合的原理設計的。在酸性溶液中,考馬斯亮蘭G-250染料與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結合變?yōu)樘m色,在595nm下測定的吸光度值與蛋白質(zhì)濃度成正比。此法靈敏度較高1~5μg,時間15min左右,干擾物質(zhì):強堿性緩沖溶液;SDS;TritonX-100。標準曲線有輕微的非線性,各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差。
雙縮脲法:雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱,放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4結合形成紅紫色絡合物,稱為雙縮脲反應。蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵,與雙縮脲結構相似,故能發(fā)生雙縮脲反應。紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,蛋白質(zhì)的種類雖不同,但發(fā)色率差別不大,組氨酸以外其它游離的氨基酸、二肽等不顯色,除雙縮脲、一亞氨基雙縮脲、二亞氨基雙縮脲、氨醇、氨基酸酰胺、丙二酰胺等少數(shù)化合物以外,非蛋白質(zhì)均不顯色,可以看做這是蛋白質(zhì)的*反應,故可用來測定蛋白質(zhì)含量。此法靈敏度較低1~20 mg,時間30 min左右,干擾物質(zhì):硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等,常用于需要快速,但并不需要十分的蛋白質(zhì)測定。
Folin-酚試劑法:酚試劑法就是來自酚試劑(磷鉬酸、磷鎢酸的混合液),在堿性條件下,和蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸的呈色反應與雙縮尿反應的復合方法。磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產(chǎn)生深蘭色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下,蘭色深度與蛋白的量成正比。此法靈敏度高5μg左右,時間1 h左右,干擾物質(zhì):尿素、硫酸納、硝酸納、三氯乙酸、乙醇、乙醚、丙酮等,測定時要控制操作時間,標準曲線也不是嚴格的直線形式,且專一性較差,干擾物質(zhì)較多。
紫外吸收光譜法:紫外吸收光譜法是直接測定芳香族氨基酸對紫外線吸收光譜(酪氨酸和色氨酸的zui大吸收為280nm)及肽鍵對紫外線吸收光譜(肽鍵的zui大吸收為190 nm)來定量蛋白質(zhì)的一種分析方法。
凱氏定氮儀法:凱氏定氮儀作為測定蛋白質(zhì)的儀器,廣泛應用于乳與乳制品中蛋白質(zhì)的含量的測定。凱氏定氮儀采用凱氏定氮法原理,即在有催化劑的條件下,用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉(zhuǎn)變成無機銨鹽,然后在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨,隨水蒸氣餾出并為過量的酸液吸收,再以標準堿滴定,就可計算出樣品中的氮量。由于蛋白質(zhì)含氮量比較恒定,可由其氮量計算蛋白質(zhì)含量,故此法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法。全自動凱氏定氮儀(http://www.dsddy.cn/)包括凱氏定氮儀蒸餾裝置和消化爐,而其他的半自動定氮儀則不含有消化爐,需要在購買時自己配置單獨的消化爐。
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